開題報告範文

二、項目研究內容和擬解決關鍵問題

研究內容:

第一部分：研究TMAO 對THP-1 巨噬細胞極化作用。

1.1 細胞實驗：

1）先用LPS處理THP-1巨噬細胞；

2）用TMAO處理THP-1巨噬細胞；

3）用TMAO預處理THP-1巨噬細胞，然後用LPS處理THP-1細胞；

1.2 上述三步實驗均檢測巨噬細胞的極化狀態及炎症指標：

①用免疫染色以及流式細胞儀檢測其極化狀態

②收集培養液，用ELISA方法測培養液中IL-6、IL-8、MCP-1的濃度；

③收集細胞總蛋白，用免疫印跡方法測ICAM-1等炎症指標表達量。

2.第二部分：研究白介素37（IL-37）對巨噬細胞M1,M2極性分化的調節作用及其在鈣化性主動脈瓣疾病炎症反應中的作用

2.1對比主動脈瓣鈣化組織病人與非鈣化對照組的組織中M1，M2型巨噬細胞的表達。通過CD68抗體，CD11c抗體免疫染色M1巨噬細胞；CD68，CD206免疫染色M2巨噬細胞；

2.2細胞實驗：

1）先用LPS和IFN-γ處理THP-1巨噬細胞；

2）用IL-37、IL-4處理THP-1巨噬細胞；

3）用IL-37預處理THP-1巨噬細胞，然後用LPS和IFN-γ處理THP-1細胞；

上述三步實驗均檢測巨噬細胞的極化狀態及炎症指標：

①用免疫染色以及流式細胞儀檢測其極化狀態

②收集培養液，用ELISA方法測培養液中IL-6、IL-8、MCP-1的濃度；

③收集細胞總蛋白，用免疫印跡方法測ICAM-1等炎症指標表達量。

第三部分：研究IL-37在調控TMAO介導的M1巨噬細胞極化中發揮的作用及其機制

細胞實驗：

3.1用免疫染色，免疫印跡以及RT-PCR方法對比來自主動脈瓣鈣化病人與非鈣化對照組的組織和細胞的IL-37水平；

3.2用IL-37蛋白多肽預處理THP-1巨噬細胞，再用TMAO處理細胞；

3.3用小干擾RNA（siRNA）沉默IL-37表達，再用TMAO處理細胞；

3.4用質粒過表達IL-37，再用TMAO處理細胞；

上述三步實驗均比較處理組和對照組炎症指標的情況，觀測指標：

1）用免疫染色以及流式細胞儀檢測其極化狀態

2）收集培養液，用ELISA方法測培養液中IL-6、IL-8、MCP-1的濃度；

3）收集細胞總蛋白，用免疫印跡方法測ICAM-1等炎症指標表達量。

4）收集細胞DNA,用chip-qpcr檢測細胞表觀遺傳修飾

動物實驗：

4.1 檢測正常小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠血清TMAO濃度。

4.2 對正常小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠分別進行：對照飲食+注射生理鹽水，高膽鹼飲食+生理鹽水，對照飲食+IL-37治療，高膽鹼飲食+IL-37治療。

4.3 用組織染色、免疫熒光染色、Elisa法等再測定正常小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠血清TMAO濃度、主動脈瓣纖維化情況、主動脈瓣組織M1和M2細胞浸潤情況及Nlrp3表達量。

擬解決關鍵問題:

1．驗證TMAO能夠誘導THP-1細胞向M1巨噬細胞極化。相關文獻提示TMAO誘導小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDMs）向M1巨噬細胞極化，然而TMAO能否誘導THP-1細胞向M1巨噬細胞極化以及能否在鈣化性主動脈瓣疾病細胞模型發揮保護作用都是關鍵問題，決定着本項目是否可行，預實驗數據的支持增加了本項目的可行性。

2．驗證白介素37（IL-37）對巨噬細胞M1,M2極性分化的調節作用及其在鈣化性主動脈瓣疾病炎症反應中的作用。前期研究提示IL-37與M1極化呈負相關，在本項目中我們需要對此進行驗證性實驗，以支持後續實驗的可行性和準確性。

3．本項目關注研究IL-37在調控TMAO介導的M1巨噬細胞極化中發揮的作用及其機制。文獻提示TMAO對M1巨噬細胞極化起正性作用，IL-37起負性作用；IL-37和TMAO均分別通過影響NLRP3炎症小體進而影響M1巨噬細胞極化。在TMAO和IL-37兩種因素共存時，他們對M1巨噬細胞極化的作用如何？它們在巨噬細胞中的作用方式是否像以前研究報道的通過影響NLRP3炎症小體發揮作用？這些問題均與研究內容密切相關，也是本項目重點關注的關鍵問題。

4．目前文獻提示IL-37通過被caspase-1切割活化後進入細胞核內參與轉錄調控，而TMAO會使巨噬細胞表現出一種高度激活的狀態。而TMAO造成的這種狀態可能是TMAO影響了巨噬細胞的表觀遺傳修飾導致的。TMAO和IL-37是否是通過影響細胞的表觀遺傳修飾來發揮作用？